胰腺癌中ASH2L和KDM4B基因的功能分析及临床意义

【摘要】影响胰腺癌增殖的组蛋白甲基化相关基因筛选目的：利用功能性高通量筛选技术,在已构建的组蛋白甲基化相关酶类病毒库中,寻找对胰腺癌增殖有意义的组蛋白甲基化相关基因。方法：通过预实验确定筛选实验所需慢病毒感染条件及MTT实验条件,利用基于慢病毒载体的功能性表观基因RNA文库(与组蛋白甲基化相关的RNA文库),进行MTT实验,在胰腺癌细胞系中筛选出对细胞增殖有明显影响的表观遗传学基因。结果：确定了本次实验最优细胞接种密度为10%,以50ul病毒感染量感染96h后,MTT检测细胞增殖,筛选出五种对胰腺癌细胞系PANC-1增殖有显著影响的表观相关基因：PRMT8,ASH2L,PRDM9,JMJD8,KDM4B。结论：功能性高通量筛选技术能够筛选出对胰腺癌细胞增殖有影响的基因,但这些基因在胰腺癌中发挥作用的分子生物学机制,有待第二部分验证。ASH2L和KDM4B响胰腺癌增殖与转移相关机制的体外研究目的：根据第一部分筛选出的阳性基因,进行细胞功能实验的验证。并研究基因对胰腺癌细胞增殖、侵袭转移及凋亡等生物学过程的影响。方法：针对ASH2L和KDM4B基因,分别构建8条RNA干扰序列,以慢病毒为载体转染胰腺癌PANC-1细胞株,利用荧光实时定量PCR检测慢病毒干扰效果,筛选出效果最佳的shRNA片段。并通过迁移试验、流式细胞学检测(FACS)和Vesternblot试验,研究调节基因表达后对胰腺癌细胞增殖、侵袭转移和凋亡等生物学特性的影响,及其可能作用的信号通路。结果：在阳性基因中选择ASH2L和KDM4B,并确定有效shRNA片段为ASH2L:044-08D、KDM4B:0029-08G。通过体外试验结果显示,下调ASH2L和KDM4B基因的表达对胰腺癌lPANC-1细胞系的增殖和迁移有明显的抑制作用；并且PANC-1细胞凋亡比例明显增加,差异有统计学意义,提示ASH2L和KDM4B基因能够抑制胰腺癌PANC-1细胞株的凋亡,是一种促癌基因。而在PANC-1细胞增殖过程中,ASH2L和KDM4B基因主要影响的是细胞的G2/M期。通过Westernblot检测,提示ASH2L和KDM4B通过Akt和ERK信号通路影响细胞的增殖能力,且分别通过Src和FAK信号通路影响胰腺癌细胞的迁移能力。结论：下调ASH2L和KDM4B基因可抑制细胞的增殖能力,且该作用可能是通过调节Akt和ERK信号通路实现的。而ASH2L和KDM4B基因可能分别通过Src和FAK信号通路影响来胰腺癌细胞的迁移能力。KDM4B基因与胰腺癌临床病理特征及预后的相关性分析目的：探讨KDM4B在人胰腺导管腺癌组织中的表达情况,分析其与患者临床病理特征及预后之间的关系。方法：选择2007年至2012年在复旦大学附属中山医院介入科行经皮穿刺活检经病理诊断为胰腺导管腺癌的Ⅲ期或Ⅳ期患者,且于术后接受动脉灌注化疗或联合靶血管栓塞治疗至少2次,生存期大于3个月,选取癌及癌旁组织共50对,利用免疫组织化学方法检测癌及癌旁组织中KDM4B蛋白的表达情况,并分析KDM4B:表达水平与患者临床病理特征及预后的关系。结果：肿瘤组织中KDM4B蛋白的阳性表达率为27/50(54.0%)；在癌旁组织中的表达率为：9/50(18%)；KDM4B的表达水平与性别、年龄、肿瘤分化级别、肿瘤部位无相关(p>0.05)；但与TNM分期之间有相关性(p<0.05)；KDM4B高表达患者的无疾病进展期较低表达患者明显降低,差异有统计学意义。结论：KDM4B基因的表达水平是影响晚期胰腺癌患者无疾病进展期的独立因素。KDM4B对吉西他滨药物敏感性影响的实验研究目的：探讨组蛋白去甲基化酶KDM4B与吉西他滨药物敏感性的关系。方法：PANC-1细胞敲除KDM4B基因后予以培养并使用嘌呤霉素盐酸盐进行筛选获得稳转株。用最终浓度为100nM的吉西他滨处理稳转株,同时设置正常培养的稳转株作为对照组,药物处理3天后,MTT法检测各组细胞的增殖活性。结果：KDM4BshRNA稳转PANC-1细胞株经WesternBlot验证表明,KDM4B表达在PANC-1细胞中被稳定抑制。在100nM吉西他滨处理KDM4BshRNA稳转PANC-1细胞株前后,MTT测得细胞活性并计算SI,得出SI=-0.04,对吉西他滨的协同性无统计学意义。结论：沉默KDM4B基因不能增强吉西他滨对胰腺癌细胞的增殖抑制作用,不足以提高胰腺癌对吉西他滨的化疗敏感性。
【作者】吴林霖；
【导师】王小林；
【作者基本信息】复旦大学，影像医学与核医学（专业学位），2013，博士
【关键词】功能性高通量筛选技术；组蛋白甲基化相关酶类病毒库；胰腺癌；ASH2L；KDM4B；RNA干扰；增殖；侵袭；病理特征；预后；吉西他滨；药物敏感性；

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